ვირუსის ნუკლეინის მჟავის გამოვლენა

ცნობილია ვირუსების უმეტესობის გენომიური თანმიმდევრობა.ნუკლეინის მჟავის ზონდები, რომლებიც წარმოადგენენ დნმ-ის მოკლე სეგმენტებს, რომლებიც შექმნილია დამატებითი ვირუსული დნმ-ის ან რნმ სეგმენტების ჰიბრიდიზაციისთვის.პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) არის ვირუსის გამოვლენის უფრო ეფექტური ტექნიკა.ბოლო დროს შემუშავებულია მაღალი გამტარუნარიანობის დიაგნოსტიკური მეთოდები.

ა. ნუკლეინის მჟავას ჰიბრიდიზაციის ტექნიკა

ნუკლეინის მჟავას ჰიბრიდიზაცია, ძირითადად სამხრეთის ბლოტინგის (სამხრეთ) და ჩრდილოეთის ბლოტის (ჩრდილოეთის) ჩათვლით, არის სწრაფად განვითარებადი ახალი ტექნიკა ვირუსის დიაგნოსტიკის სფეროში.ჰიბრიდიზაციის ანალიზის დასაბუთება არის დნმ-ის მოკლე სეგმენტების (ე.წ. „ზონდი“) გამოყენება, რომლებიც შექმნილია დამატებითი ვირუსული დნმ-ის ან რნმ სეგმენტების ჰიბრიდიზაციისთვის.გახურებით ან ტუტე დამუშავებით, ორჯაჭვიანი სამიზნე დნმ ან რნმ იყოფა ერთ ძაფებად და შემდეგ იმობილიზირდება მყარ საყრდენზე.ამის შემდეგ, ზონდი ემატება და ჰიბრიდირებულია სამიზნე დნმ-თან ან რნმ-თან.ვინაიდან ზონდი ეტიკეტირებულია იზოტოპით ან არარადიოაქტიური ნუკლიდით, სამიზნე დნმ ან რნმ შეიძლება გამოვლინდეს ავტორადიოგრაფიით ან ბიოტინ-ავიდინის სისტემით.ვინაიდან ვირუსული გენომის უმეტესობა კლონირებული და თანმიმდევრული იყო, მათი აღმოჩენა შესაძლებელია ვირუსის სპეციფიკური თანმიმდევრობების გამოყენებით, როგორც ზონდები ნიმუშში.ამჟამად, ჰიბრიდიზაციის მეთოდები მოიცავს: წერტილოვანი ბლოტი, უჯრედებში in situ ჰიბრიდიზაცია, დნმ-ის ბლოტი (დნმ) (სამხრეთ ბლოტი) და რნმ ბლოტი (რნმ) (ნორტერნ ბლოტი).

B.PCR ტექნოლოგია

ბოლო წლებში შემუშავდა ინ ვიტრო ნუკლეინის მჟავების ამპლიფიკაციის ტექნიკის სერია PCR-ზე დაფუძნებული, უგრძნობი ან არაკულტივირებადი ვირუსების შესამოწმებლად.PCR არის მეთოდი, რომელსაც შეუძლია დნმ-ის სპეციფიკური თანმიმდევრობის სინთეზირება ინ ვიტრო პოლიმერაზას რეაქციით.PCR პროცესი მოიცავს თერმულ ციკლს სამი საფეხურისგან: დენატურაცია, ანილირება და გაფართოება მაღალ ტემპერატურაზე (93℃~95℃), ორჯაჭვიანი დნმ იყოფა დნმ-ის ორ ერთ ჯაჭვად;შემდეგ დაბალ ტემპერატურაზე (37℃~60℃), ორი სინთეზირებული ნუკლეოტიდური პრაიმერი ანელდება დნმ-ის დამატებით სეგმენტებზე;მაშინ როცა Taq ფერმენტის შესაბამის ტემპერატურაზე (72℃), ახალი დნმ-ის ჯაჭვების სინთეზი იწყება პრაიმერის 3' ბოლოდან დამატებითი დნმ-ის შაბლონებად და ცალკეული ნუკლეოტიდების გამოყენებით.ასე რომ, ყოველი ციკლის შემდეგ, ერთი დნმ-ის ჯაჭვი შეიძლება გაძლიერდეს ორ ჯაჭვად.ამ პროცესის განმეორებით, ერთ ციკლში სინთეზირებული თითოეული დნმ-ის ჯაჭვი შეიძლება გამოყენებულ იქნას შაბლონად შემდეგ ციკლში და დნმ-ის ჯაჭვების რაოდენობა ორმაგდება თითოეულ ციკლში, რაც ნიშნავს, რომ PCR-ის წარმოება გაძლიერებულია 2n log სიჩქარით.25-დან 30 ციკლის შემდეგ, PCR-ის წარმოების იდენტიფიცირება ხდება ელექტროფორეზის მეშვეობით და დნმ-ის სპეციფიკური პროდუქტების დაკვირვება შესაძლებელია ულტრაიისფერი შუქის ქვეშ (254 ნმ).სპეციფიკურობის, მგრძნობელობისა და მოხერხებულობისთვის, PCR მიღებულია მრავალი ვირუსული ინფექციის კლინიკურ დიაგნოზში, როგორიცაა HCV, HIV, CMV და HPV.ვინაიდან PCR ძალიან მგრძნობიარეა, მას შეუძლია აღმოაჩინოს ვირუსის დნმ fg დონეზე, ოპერაცია უნდა ჩატარდეს ძალიან ფრთხილად, რათა თავიდან იქნას აცილებული ცრუ დადებითი.გარდა ამისა, ნუკლეინის მჟავას ტესტის დადებითი შედეგი არ ნიშნავს, რომ ნიმუშში ცოცხალი ინფექციური ვირუსია.

PCR ტექნიკის ფართო გამოყენებით, PCR ტექნიკის საფუძველზე შემუშავებულია ახალი ტექნიკა და მეთოდები სხვადასხვა ტესტირების მიზნით.მაგალითად, რეალურ დროში რაოდენობრივ PCR-ს შეუძლია ვირუსული დატვირთვის გამოვლენა;in situ PCR გამოიყენება ქსოვილებში ან უჯრედებში ვირუსული ინფექციის დასადგენად;ჩადგმულ PCR-ს შეუძლია გაზარდოს PCR-ის სპეციფიკა.მათ შორის, რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR უფრო სწრაფად განვითარდა.ბევრი ახალი ტექნიკა, როგორიცაა TaqMan ჰიდროლიზის ზონდი, ჰიბრიდიზაციის ზონდი და მოლეკულური შუქურის ზონდი, გაერთიანდა რეალურ დროში რაოდენობრივ PCR ტექნიკაში, რომელიც ფართოდ გამოიყენება კლინიკურ კვლევებში.პაციენტის სხეულის სითხეში ვირუსული დატვირთვის ზუსტად განსაზღვრის გარდა, ეს მეთოდი ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას წამლისადმი ტოლერანტული მუტანტის გამოსავლენად.აქედან გამომდინარე, რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR ძირითადად გამოიყენება სამკურნალო ეფექტის შეფასებასა და წამლების ტოლერანტობის ზედამხედველობის დროს.

C. ვირუსული ნუკლეინის მჟავების მაღალი გამტარუნარიანობის გამოვლენა

ახალი გადაუდებელი ინფექციური დაავადებების სწრაფი დიაგნოსტიკის მოთხოვნილებების დასაკმაყოფილებლად, შეიქმნა სხვადასხვა მაღალი გამტარუნარიანობის გამოვლენის მეთოდები, როგორიცაა დნმ-ის ჩიპები (დნმ).დნმ-ის ჩიპებისთვის სპეციფიური ზონდები სინთეზირდება და მიმაგრებულია მცირე სილიკონის ჩიპებზე ძალიან მაღალი სიმკვრივით, რათა წარმოქმნას დნმ-ის ზონდის მიკრომასივობა (დნმ), რომელიც შეიძლება ჰიბრიდირებული იყოს ნიმუშთან.ჰიბრიდიზაციის სიგნალის გადაღება შესაძლებელია კონფოკალური მიკროსკოპის ან ლაზერული სკანერის საშუალებით და შემდგომი დამუშავების კომპიუტერის მიერ და შესაძლებელია სხვადასხვა გენების შესახებ უზარმაზარი მონაცემთა ნაკრების მიღება.არსებობს ორი სახის დნმ-ის ჩიპი.„სინთეზის ჩიპი“ შემდეგია: სპეციფიკური ოლიგონუკლეოტიდები სინთეზირდება უშუალოდ ჩიპებზე.მეორე არის დნმ-ის აუზის ჩიპი.კლონირებული გენები ან PCR პროდუქტები მოწესრიგებულად იბეჭდება სლაიდზე.დნმ ჩიპის ტექნოლოგიის უპირატესობა არის დნმ-ის მიმდევრების უზარმაზარი რაოდენობის ერთდროული აღმოჩენა.პათოგენის აღმოჩენის ჩიპის უახლეს ვერსიას შეუძლია ერთდროულად 1700-ზე მეტი ადამიანის ვირუსის იდენტიფიცირება.დნმ ჩიპის ტექნოლოგიამ გადაჭრა ნუკლეინის მჟავების ჰიბრიდიზაციის ტრადიციული მეთოდების პრობლემები და აქვს ძალიან ფართო გამოყენება ვირუსების დიაგნოზსა და ეპიდემიოლოგიურ კვლევაში.